刘沐芸:输血技术延伸的新技术(细胞治疗)领域基础研究方向及应用进展

作者:刘沐芸    来源:个体化细胞治疗技术国地实验室

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本文根据刘沐芸博士在2022年8月6日,由深圳市血液中心、中国医学科学院输血研究所联合举办的主题为“前沿观点 共创未来”的首届深圳血液安全高峰论坛上的演讲报告整理。


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为什么说细胞治疗是输血技术的延伸?


细胞治疗,是一种利用细胞治疗疾病的医疗方式,有自体的细胞治疗,比如目前较为流行的Car-T治疗;也有异基因细胞治疗,比如脐带来源的间充质干细胞治疗等。


输血是最常见、也是历史悠久的细胞治疗,比如红细胞,白细胞,血小板的输注等;还有一种较为常见的是造血干细胞移植。但是,输血治疗和造血干细胞移植,与前面的讲的细胞治疗、Car-T和MSC,又有些不同。主要的不同在于,输血和造血干细胞移植的主要作用是功能的替代。


而目前常用的、产品化的细胞治疗已经不仅仅是功能替代或功能再生,而是作为临床治疗工具,可以向药品那样在生产车间进行操作、工程化改造等,赋予细胞一些不局限于其原生的生理功能,以更好地发挥治疗作用。因此,细胞治疗是输血技术的延伸。


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国际CGT产业发展概况


目前,截止2022年上半年,全世界有1308家以CGT为主营业务的公司,主要分布在北美地区,排在第二的是亚太地区410家,欧洲地区有230家。


全球CGT行业的竞争态势,无论是在公司数量(613家),还是研究项目(产业界发起的临床研究有566项,学界和政府发起的研究项目有436项),亦或是资本市场的活跃程度(融资额高达176亿美金),都是美国领先。尤其是资本市场的活跃度,这是否也暗示了美国CGT产业发展快速发展,并呈现领先发展态势的一个原因呢?


与欧洲地区相比,亚太地区的公司数量(410家)和临床研究项目(业界发起314项,学界与政府资助372项)超过欧洲(230家,业界发起200项临床研究,学界与政府发起160项)。但是资本的活跃度却不如欧洲地区,亚洲地区的投融资为22亿美金,欧洲地区33亿美金。公司数量与研究项目多,但资本助力表现乏力,是否预示着,亚太地区CGT产业的发展后劲不足呢?


并且还有一个有意思的现象,临床研究项目中,亚太地区是唯一一个,学界和政府发起的临床研究项目数量超过企业界发起的临床研究项目数量的地区。


太地方有2个国家——日本和中国,采取的技术和产品并行的双轨制,这是否从另一个角度反映了“学术界发起的临床研究数超过企业界发起的研究数”的原因呢?是否也反映出,亚太区学界和业界在创新链和产业链上的分工有待进一步明确呢?毕竟一个新的疗法要做强做大,产业发展是经过检验的有效路径。


目前,全球有2406项临床研究项目在进行中,比2020年下降了15%。下降主要是因为学术/政府发起的研究项目的减少导致,下降了21%;产业界发起的研究项目也有下降了8%。


产业界发起的1171项研究项目中,12%(142项)进入临床III期。学术界发起的研究有1235项,但相较产业界研究,学术界发起的研究处于早期,仅有2.5%(31项)进入III期。


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在产业界发起的研究项目中,免疫细胞治疗研究占41%(484项),超过其他细胞治疗(441项),并呈现出持续增长的趋势,但多处于临床I期,仅有22%进入临床III期。业界发起的基因治疗临床研究项目达225项,其中41项进入临床III期。


但在学界和政府发起的临床研究中,细胞治疗却占多数,差不多58%的项目都是细胞治疗(714项),当然免疫细胞治疗也不少(413项),但基因治疗临床研究就比较少(91项)。学界与政府的研究偏好是否代表了CGT行业未来发展的风向标?


肿瘤学仍然是CGT研究的主要适应症,正在进行的临床试验项目中,超过一半的研究项目是肿瘤治疗。血液系统恶性肿瘤仍然是CGT产品攻克的主要目标。实体瘤研究的关注度在持续增加,目前实体瘤的临床试验占整个肿瘤试验的45%;最常见的实体瘤为胃肠肿瘤,占据了实体瘤研究的23%。


基因疗法:虽然2022年可能会是基因疗法治疗罕见病的一个大年,但我们仍然看到,基因治疗针对流行病的研究进展迅速。2021年,Vertex公司公布了I型糖尿病试验的里程碑结果,2022年,会有更多的治疗流行病的基因治疗的研究数据公布。


因此,我们相信,在美国,或欧洲,很快会有治疗流行病的基因治疗产品的上市,目前进入III的基因治疗产品的适应症包括,严重肢端缺血,充血性心力衰竭,糖尿病性周围神经病变,黄斑变性。


目前开展的2406项基因治疗临床试验中,59%针对的是流行病。在学界/政府发起的了临床研究中,更为明显,62%针对的是流行病,业界为56%。这表明学界与业界的分工较为明确,学界负责早期探索,业界负责对有确定疗效的产业进行转化。


基因编辑治疗的情况:目前基因编辑产品的临床研究主要集中在I期,II期。基因编辑的主要工具,大部分还是采用的经典的CRISPR,其他有少部分为TALEN 和ZFN。


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国家工程研究中心先进CGT智造研发平台的研究成果与未来发展方向


今年6月,我单位获批“联合产业上下游,建设细胞产业关键共性技术国家工程研究中心”的任务。开展细胞治疗、先进智造、质量检测能力等关键核心技术攻关,建设产业共性技术研究和工程验证平台,推动细胞制备由当前的劳动密集型、手动操作向全自动、全封闭、连续性的无人智造转变,切实提升我国生物产业国际竞争力。


国家工程研究中心与承担0-1基础研究的国家实验室,以及100以后产业发展的制造业创新中心共同构成了国家创新体系,国家工程研究中心通过应用基础研究与工程突破,承担着创新链向产业链转化过程中的“1-100”的技术发明,在科学发现与产业发展之间构建一个连接的桥梁和通道,保障基础研究成果的产业转化的成功率与效率。


本单位牵头组建的细胞产业关键共性技术国家工程研究中心,包含了4个方向的关键技术攻关平台,4个方向的产业共性需求服务平台。今天重点介绍是,国家工程研究中心先进CGT智造研发平台的研究成果与未来研究重点——过程控制与细胞质量


干细胞是生命科学研究的前沿和重点,干细胞研究有助于认识细胞生长、分化和器官形成的规律,有助于阐明多种疾病的发病机制,也因此在研究的过程中,产生过多项诺贝尔生理学/医学奖的研究成果。


比如,2007年的胚胎干细胞分化,2010年的人工辅助生殖,2012年的干细胞克隆与ips技术等。


细胞治疗具有“满足临床重大疾病治疗需求”的发展潜能。我国人口众多,慢病、肿瘤、退行性疾病的人群基数都非常庞大,再加之,近年来人口老龄化程度的加剧,都为干细胞技术得以突破性、快速发展奠定了基础。尤其是,一些需要“长期服药控制,并会带来沉重的经济负担”的慢性、非传染疾病(如糖尿病、心脏病等),罕见病、疑难病等的治疗。


随着细胞治疗时代的到来,干细胞技术的研究突破、产业政策的扶持,干细胞技术能为前述疾病的治疗带来新希望,为重大难治疾病提供新的治疗策略。


我国政府也高度重视干细胞与再生医学的发展:总书记在中国科学院第17次、中国工程院第12次院士大会的讲话中,重点提及了“干细胞研究“等基础科学的突破,为我国经济社会发展提供坚强支撑,也为我国作为一个有世界影响的大国奠定了重要基础。


干细胞与再生医学作为重大科技项目,列入了《健康中国2030规划纲要》,国家科技部、卫健委、发改委等9部门联合印发的《145医药工业发展规划》中,明确将“免疫细胞治疗、干细胞治疗、基因治疗”等纳入规划内容,干细胞也被正式写入了我国的《第14个五年规划和2035年远景目标纲要》。今年7月,细胞治疗技术也列入了深圳的20+8产业规划中。


间充质干细胞,简称MSC,具有来源广泛,易于扩增、多向分化的特点,同时还具有免疫调节、旁分泌、定向病损组织迁移等治疗效能的特点。因此,MSC具有广阔的临床应用前景,也被认为是临床细胞治疗最优秀的“选手”之一。目前,国际注册的MSC临床试验共计1400多项,韩国、日本、欧洲、加拿大/新西兰,印度等国家和地区先后批复了MSC产品上市,进入临床使用。但至今,中国和美国都未有批复MSC上市。


干细胞的前景如此好,但为什么到目前为止,我国却尚未批复一款干细胞产品上市,反倒是后来的CAR-T产品却陆续获批上市?


这是因为,MSC存在功能异质性。不同组织来源的MSC,尽管基本特性相同(如表面标志物、多向分化能力等),但其功能存在差异;同样,不同生产、培养条件获得的MSC,具有相同的基本特性,但细胞功能却各有千秋,临床治疗效果也不稳定。


美国FDA的“细胞与组织治疗”部门的负责人,Dr. Steven R Bauer 在其综述“临床试验的干细胞产品特性—FDA视角”《MSC-based Product Characterization for Clinical Trials: An FDA Perspective》中,也提到了,对MSC临床疗效稳定性的担忧。并且,他还认为,要清晰的认识到,即使是符合ISCT鉴定标准的MSC,其性质也存在差异,也就是前面提到的异质性。


为什么MSC非常有转化前景,但却转化受阻?


当前,MSC常用的鉴定指标和方法:MSC的鉴定指标仍然沿用国际细胞治疗协会(ISCT)推荐的最低标准,包括表面标记的表达,分化潜能以及贴壁生长等。满足ISCT的标准,只能表明,送检的细胞是MSC,但无法表明这些细胞的生物学效能;由于是取样送检,无法反应其生产过程中的细胞生长状态,也就无法筛选出与临床治疗效果相匹配的目标细胞;也因此,MSC虽然符合标准,但临床治疗效果却存在差异,导致其临床转化受阻。


从ISCT标准的检测方法,可以看出,取样送检,对样本进行染色处理,检测方法为侵入性的,而取样送检,也表明:该方法无法实时连续监测细胞生产的全过程。


目前用于检测细胞质量的方法为侵入性方法,存在一定的局限性:需要对样本进行染色处理,取样送检,则导致检测样本与实际收获、放行的产品不是同一个;耗时长,检测结果与生产进程不同步;样本染色等处理繁琐,导致成本高,通量低;检测结果与操作人员密切相关,无法全面反映与临床治疗疾病相关的质量属性。


手工、开放、间断操作的细胞产品生产方式,导致生产端的细胞数据与临床治疗效果之间无法形成汇聚和反馈,因为手工操作的生产记录反映的是SOP要点,无法“保真、再现”其细胞的生成过程,因此无法形成“端到端”的细胞数据与临床治疗效果数据的反馈。


也因此,临床中的治疗效果的优劣、好坏等无法从细胞培养生长过程进行溯源,无法回答“为什么明敏复合标准但疗效不稳定”,国际也经常有“MSCs到了III期疗效不佳”的监管披露:即便是符合ISCT的标准,但临床疗效仍然不稳定,导致临床研究失败。


因此,迫切需要探索一种能指导生产的新方法、替代性指标,监测不同培养条件下的细胞生长状态,并能将反映细胞功能亚群的,关键质量属性整合为关键过程参数,用于高效筛选目标细胞,促进干细胞治疗技术高质量临床转化。


这其中的关键科学问题是:在ISCT的最低标准基础上,还应建立能反应细胞功能亚群的关键质量属性(CQA),如形态学特征,并与关键过程参数整合,用于生产过程中的质量控制;探讨研究一种细胞关键质量属性和关键过程参数的测量方法,研究实时、能全面反映干细胞质量的替代性标记,开发一种无损、在线、连续测量的模块,以指导、控制生产过程,用于支持“筛选富集目标细胞”,获得理想的细胞治疗效果。


通过过程控制技术关联细胞质量的技术路线:将不同的MSC进行研究分析,获取其生物学特征;同时,利用不同生产培养条件处理MSC,再将处理后的MSC进行光学分析,以获得不同处理条件下的MSC形态学特征;最后通过人工智能与数据分析,探索建立“细胞生物学特征、细胞功能与形态学特征关联”的数据库,揭示制备过程中细胞生长状态的变化,建立细胞质量过程监测标准,开发非侵入、在线、连续监测方法。


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国家工程研究中心先进CGT智造平台的主要工作






在细胞生物学方面,本团队在ICST标准的基础上,建立一套能反映细胞功能的MSC表达谱,比如,IFGB7高表达的MSC具有调控T细胞的效能;GREM1高表达的MSC具有促进血管形成的效能。但细胞表达谱的检测分析也需要对样本进行标记处理,因此难以直接用于生产过程中筛选与临床适应症相符合的目标细胞,于是我们设想,有没有一种方法能将生物学研究成果转化为,可以用于指导生产的量化指标,高效地筛选目标细胞。


通过连续观察细胞生产过程中,细胞形态的变化曲线,来反映细胞功能亚群,并作为细胞收获的决策依据?因为,细胞物理形态特征的观察,不需要对细胞染色,能够原位实现。于是,我们以生物学研究为基础,采用卷积神经网络(CNN)建立了“细胞图像获取工具和识别算法”,以追踪细胞状态的变化。


利用平台开发工具和算法,开展了一系列实验研究,我们通过卷积神经网络和反向传播神经网络技术,建立了细胞形态学参数的获取方法。


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这些图片,从左到右,最左边的为原始图片,第2张图片为预处理结果,第3张为内部高密度物质提取结果,第4张为完整的细胞重建结果。


研究表明,我们的工具和方法具有可行性,能够通过图像获取 细胞形态学参数。我们团队还继续做了细胞功能与物理形态关联的研究,比如,细胞尺寸、细胞内部复杂程度与细胞质量的关系。研究发现,细胞尺寸、内部复杂程度与细胞质量有较强的相关性。


主要研究成果已经公开发表。利用数字孪生技术结合轻量深度学习(卷积神经网络CNN)技术实现对干细胞图像分割识别、追踪[1]应用反向传播神经网络(BPNN)边缘计算,选取细胞形态学参数“周长、面积、圆度、平均直径、长、宽” 去识别目标细胞,并对研究细胞进行计数,预测结果与实际数据非常接近,证明方法可行[2]


目前已经将研究成果应用于封闭式、全自动、连续性细胞生产的过程中细胞产品CAQ的监测判断,以决策细胞是否符合收获标准,指导连续性、封闭式、自动化生产。


非侵入、实时、在线细胞状态分析技术支持的封闭式、连续性、规模化、全自动CGT产品生产装备。生产过程自主获取“能反映生产过程质量指标的细胞图像”,以指导连续性生产。


手工操作的细胞产品生产方式,导致生产端的细胞数据与临床治疗效果之间无法形成汇聚和反馈。我们用人工智能与图像识别,建立一种可以适用于封闭式、自动化连续生产的细胞生长监测方法,实现细胞形态特征表达关键质量属性。


我们的研究发现,细胞培养过程中,最佳生长状态的MSC的细胞形态呈现“细长梭形”,并表现出可测量的“高的长宽比与低的核质比”的物理特征以量化前述的细胞形态——什么样的细长梭形就是好的,生物学校验发现,这种物理形态的MSC的这几个标记物CD105、STRO-1、CD29、CD44呈现高表达。


而衰老状态的MSC从形态上就“长”得肥大而突出,其物理特征为“低的长宽比与高的核质比”,与标记物(CD105、STRO-1、CD29、CD44)低表达。


智能生产能便捷地将生产端的细胞数据与临床端的患者、疾病特征进行关联,并通过每批次细胞的临床治疗效果来呈现细胞质量与疾病治疗的相互关系,形成能反应临床过程中“干细胞治疗某种适应症的安全性与有效性”,同时回答“为什么有效且一直有效”的问题。


国家工程研究中心先进CGT智造平台长期发展目标:研究成果的推广应用,获得行业发展话语权。






目前,现行用于筛选“临床研究和治疗”所需的MSC的标准,是国际细胞治疗学会(ISCT)制定的标准,ICST也一再重申,该标准仅仅是推荐的最低标准,只能表明送检细胞为MSC,不能反映其与临床适应症相匹配的功能属性。


也正是因为“缺乏有效的对MSC生物学功能的监测指标和方法”,这也导致MSC治疗效果不稳定、乃至临床研究治疗失败;鉴此,本项目通过大批量的MSC生物学特征、形态学特征以及临床治疗效果数据分析,建立一种量化的“功能相关形态学特征”作为测量指标,高效筛选适合不同疾病治疗的MSC,并建立适合不同疾病治疗的特异性MSC评价标准,实现精准化治疗。


国家工程研究中心先进CGT智造平台总体发展定位:4个面向。






以“细胞生物学、光学、人工智能”等基础学科的交叉融合,研究全自动CGT智造系统,实现细胞治疗封闭式、自动化、连续性、大规模生产制造,形成重大理论突破,抢占产业发展的理论高地,实现CGT制造供应链安全可控,面向世界科技前沿以及国家重大需求


通过重大成果转化,致力于CGT产品的质量一致、成本可担、物理可及,面向人民生命健康,实现病有良医,健康美丽。


产生重大应用成果,面向经济主战场,促进细胞产业高质量发展,形成细胞治疗新服务、新产业与新业态。





[1] XiangXi Du, MuYun Liu, YanHua Sun, "Segmentation, Detection, and Tracking of Stem Cell Image by Digital Twins and Lightweight Deep Learning", Computational Intelligence and Neuroscience, vol. 2022, Article ID 6003293, 10 pages, 2022.

https://doi.org/10.1155/2022/6003293


[2] Xiangxi Du, Muyun Liu, Yanhua Sun, "Cell Recognition Using BP Neural Network Edge Computing", Contrast Media & Molecular Imaging, vol. 2022, Article ID 7355233, 7 pages, 2022. 

https://doi.org/10.1155/2022/7355233


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